顯微鏡(熒光倒置顯微鏡）國產(chǎn)和進口如何選擇？
2020-10-29
顯微鏡(熒光倒置顯微鏡）國產(chǎn)和進口如何選擇
一般教學用途及要求的，建議使用國內(nèi)產(chǎn)品；科學研究等特殊要求的，建議采購進口產(chǎn)品。國產(chǎn)品牌沒有高質量熒光激發(fā)塊，同時也沒有高數(shù)值孔徑物鏡，視野僅22mm，而進口品牌有高質量熒光激發(fā)塊，物鏡數(shù)值孔徑可達到0.7，視野25mm，可以獲得高清晰圖像、具有更大觀察及成像面積。
熒光顯微鏡是利用特定波長的光照射被檢物體產(chǎn)生熒光進行鏡檢的顯微光學觀測技術，已有100多年歷史。近年來，由于免疫熒光在醫(yī)學研究、診斷領域里的廣泛應用，F(xiàn)ISH、綠色熒光蛋白(GFP)技術分別在基因組學、蛋白質組學研究方面的推廣，顯微照相、數(shù)字CCD成像技術的輔助驅動，賦予這一傳統(tǒng)技術更新的應用價值和生命力。
基本原理
熒光：是一種非溫度輻射冷光，據(jù)發(fā)生性質可分為光化熒光(由特定光源光譜激發(fā)而產(chǎn)生的熒光)、放射熒光(放射性物質激發(fā))、生物熒光(生物體發(fā)出)、化學熒光(如磷氧化時)等。
熒光現(xiàn)象：某物質在受到某種特定波長的高能量光(短波長)照射后獲取能量，幾乎即時(約在10～15s后)其分子內(nèi)的電子躍遷到較高能級軌道使分子進入激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的分子不通過內(nèi)部轉換方式消耗能量回到基態(tài)，而是釋放出相應較低能量的光量子→人眼可見的熒光(較長波長)。
熒光現(xiàn)象有兩種：一次熒光現(xiàn)象，又稱“固有熒光”或“自發(fā)熒光”，是指經(jīng)照射后，就能發(fā)出熒光的物質，此類物質的化學特征是發(fā)光分子具有共軛雙鍵，π電子活動性大。二次熒光現(xiàn)象，又稱“繼發(fā)熒光”，物質經(jīng)照射后不能或只能部分發(fā)生微弱的熒光，這樣就需先用熒光色素(或稱熒光染料、熒光探針)標記處理，將熒光色素標記結合插入到不發(fā)光的活性分子中去，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。熒光色素應具備的基本條件是能與不發(fā)光分子的某個區(qū)域有特異性的牢固結合，同時不會影響被結合分子的結構和特性，光量子效率應≥013。
熒光的產(chǎn)生包含了激發(fā)(Excitation)和發(fā)射(Emission)兩個過程，激發(fā)光譜短于發(fā)射光譜，故光色不同。而不同的熒光物質或熒光色素有其最敏感而有效的激發(fā)波長，因此選擇合適的激發(fā)/發(fā)射光譜以獲得最佳的熒光鏡像質量是實驗中要首先考慮的。
熒光顯微鏡是利用“光化熒光”成像，如果所選激發(fā)波長在肉眼所看不見的近紫外光區(qū)(320～400nm)，熒光的發(fā)射光譜也較普通光鏡光源的平均波長短，光學分辨率提高。
應用要點
1)預檢查和調(diào)節(jié)
(1)每次進行熒光觀測前，必須例行檢查熒光裝置的燈絲對中、光路對焦、孔徑光闌、視場光闌設置等狀況。
(2)所需要的熒光激發(fā)/發(fā)射濾光片組件是否已裝在轉換器中，物鏡配置是否得當，除去物鏡前透鏡的油漬和灰塵。
(3)如同時進行透射光相差觀察，要檢查聚光鏡對中心及相差環(huán)與物鏡相反的共軛情況。
(4)檢查樣品載體(載玻片、蓋玻片和其他器皿)有否掛有液體、灰塵，厚度是否在物鏡標定的工作距離范圍內(nèi)。切片樣品不能太厚，約≤10μm為宜。
(5)因照明光源含有紫外線，在載物臺前上方放一塊棕色遮光板，以防紫外線損傷視網(wǎng)膜。
(6)電壓不穩(wěn)會降低高壓汞燈的使用壽命，光源電源最好加配穩(wěn)壓器。
(7)為延長汞燈壽命，在開啟后15min方可關閉；汞燈熒光電源一旦關閉，再次啟動至少需等待10min，以使水銀蒸汽冷卻復至原態(tài)，否則會影響燈的壽命。
2)熒光鏡像觀察
(1)在開啟熒光燈源后約5～10min激發(fā)光強度趨于穩(wěn)定，裝載樣品進行觀察；為防止在調(diào)焦和尋找物像過程中過度激發(fā)光照會造成樣品熒光淬滅，最好先通過縮小熒光照明器的孔徑光闌或加ND濾光片將激發(fā)光調(diào)節(jié)到適度強度，有規(guī)律地移動樣品臺，待確定鏡像后，在調(diào)節(jié)到最佳熒光狀態(tài)用于拍攝記錄。
(2)鏡像質量不佳的調(diào)整。排除樣品制備因素外，可進行的必要調(diào)節(jié)措施是：
①排除成像光路中的遮光或限光器件，如DIC附件、ND濾光片等。
②重新調(diào)節(jié)熒光照明器的收光器對焦和孔徑光闌大小。
③細心調(diào)節(jié)物鏡覆蓋差校正環(huán)。
④復查熒光激發(fā)/發(fā)射組件是否與所標記的熒光色素對應。
(3)在不影響分辨率的前提下，于照相取景框和CCD靶面范圍之外，可盡量回縮熒光光路視場光闌和物鏡(100X物鏡)的數(shù)值孔徑光闌調(diào)節(jié)環(huán)，以避免雜散光的影響、提高景深，并可減小激發(fā)面積防止附加樣品淬滅。
(4)暫時不觀察時，應阻斷激發(fā)光路。
(5)油鏡觀察時，須用“無熒光油”，尤其是在U、V激發(fā)時，因常規(guī)鏡檢用的香柏油帶有青色熒光。
3)熒光照相和數(shù)字CCD相機圖像采集
(1)熒光照相
①盡管肉眼觀察熒光鏡像亮度與普通明場相差無幾，而實際上曝光時間要增加數(shù)倍甚至幾十倍，應使用快速感光膠片，如ISO200(24DIN)、ISO400(27DIN)。
②根據(jù)熒光物像在測光區(qū)的分布比例和鏡像的明暗程度設置曝光補償調(diào)節(jié)，原則上適當增補償，以獲得背景黑暗熒光圖像明亮、鮮艷的照片效果。
③如果沒有照明標線取景器，可先選擇較明亮的熒光區(qū)域進行對焦調(diào)整。
④對點狀熒光物像或撲捉某點為主的拍攝，可選擇適當?shù)狞c測光模式。
⑤對在同一幅需要同樣條件拍攝的分散點狀熒光物像，可試用點測光配合自動鎖定方式拍攝。
⑥曝光過程應避免任何振動，有條件可配置防震臺。
(2)數(shù)字CCD相機圖像采集
①光學接口的中間倍率要與CCD的芯片尺寸合理匹配。
②采用合適的熒光拍攝模式，摸索減背景(Background Subtraction)處理條件，根據(jù)鏡像情況設置Binning、Gain、Gamma等參數(shù)。
③因CCD芯片靈敏度較高，如果熒光鏡像過于明亮，為獲取對比度較好的采集圖像，可適當縮小熒光照明器孔徑光闌或加ND濾光片，特別是在熒光輝光較強影響拍攝樣品細節(jié)的情況時。
實際工作中，為獲得較好的熒光圖像拍攝質量需要對上述調(diào)節(jié)機制的綜合運用，反復摸索、優(yōu)化條件。
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