酶聯免疫吸附法檢測瘦肉精
2011-04-07
酶聯免疫吸附法是目前最佳的檢測方法。ELISA 檢測方法有雙抗體夾心法測抗原、間接法測抗體、競爭法測抗體等。該文是利用酶聯免疫吸附法中的競爭法測抗體,其原理是利用多克隆抗體既能與鹽酸克倫特羅結合,也能與包被抗原結合。這些包被抗原被固定在酶標板孔壁上,當樣品中含有瘦肉精時,它與包被抗原競爭結合抗體中有限量的結合位點。由于每一個孔中抗體的結合位點數相同,當樣品中瘦肉精濃度低時,就有更多抗體的位點與包被抗原結合,更多的抗體被固定在酶標板壁上,就會與更多的酶標二抗結合,所以結果就呈現深蘭色。相反,樣品的瘦肉精濃度高,結果就呈現淺蘭色。加入終止液后,蘭色相應變成黃色,然后用酶標儀進行測定。利用競爭酶聯免疫吸附法檢測瘦肉精,具有速度快,靈敏度高的特點,適用于現場檢測,對以后瘦肉精檢測工作的發展具有指導作用。
1 實驗材料與方法
1.1 原料的準備
抽取具有一定批量的有代表性的無皮豬肉,剔除雜質、脂肪。將精肉用高速搗碎機搗碎混合均勻,放置冰箱冷凍備用。取搗碎的樣品5g ,加入25mL ,50mmolHCl 振動1.5h ,以達到均質。稱取5g均質物(相當于1g 肝臟或肌肉),加入離心管中,10000r/min 離心15min。取上清液至另一個離心管中, 加1mol NaOH 300ul , 混合15min。加入4mL ,500mmol KH2PO4 (pH3.0),迅速混勻置于4攝氏度的冰箱內保存至少1.5h。10000 r/min 離心15min ,分離上清液。
1.2 試劑
鹽酸克倫特羅—酶聯免疫試劑盒
1.3 儀器
電熱恒溫水浴鍋、酶標儀、離心機、勻漿機(HFJ系列內切式勻漿機，廠家：天津恒奧)、微量加樣器。
1.4 方法
1.4.1 洗板 所有試劑回溫至室溫。將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10 倍。將酶聯免疫板取出,放在室溫下平衡5min。每孔加入300uL 洗液,放置1min ,再甩掉洗滌液,重復3 次,將板內殘留洗滌液在吸水紙上甩干。
1.4.2 競爭 試劑盒中的抗體按1∶1000 倍稀釋。加樣時在板上按1 到3 的順序加入標樣,每孔100uL ,重復兩次,其它孔加入待測樣品,每孔100uL 抗體,注意加入抗體時不要讓槍頭沾染孔里的樣品與標準樣,然后將酶標板放入濕盒里,在37攝氏度下競爭30min。
1.4.3 加二抗 試劑盒中的二抗標記酶按1 :1000 稀釋。在酶聯板上每孔加200μL 配制好的二抗標記酶,將其放入濕盒,置37攝氏度、30min。
1.4.4 加底物顯色 取底物A、底物B 按等體積混勻,在酶標板上每孔加200μL 配好的底物顯色板顯色,顯色后每孔加入50uL 的終止液終止反應。在酶標儀上測定各標準樣和各樣品450nm 處的光密度(OD)值,用瘦肉精標準液200ng/mL 孔作為0孔。
2 討論
2.1 試劑盒的貯存
試劑盒在4攝氏度貯存。抗體和酶標二抗(IGg-HRP)在常溫下容易變性,須冷凍保存,使用時直接拿出按比例稀釋。
2.2 加樣
實驗中有3 次加樣步驟,即加標本、酶結合物和底物。加樣時應將所加物用微量加樣器加在ELISA板孔的底部,可用左手扶住微量加樣器的中部,避免加在孔壁上部,并防止濺出和產生氣泡,導致實驗誤差。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器,使加液過程迅速完成。
2.3 保溫
在實驗中有兩次抗原抗體反應,即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間,這一保溫過程稱為溫育(incubation)或孵育。因為ELISA 屬固相免疫測定,抗原、抗體的結合只在固相表面上發生,加入板孔中的標本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會,只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。溫育的溫度通常是37攝氏度,也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。兩次抗原抗體反應一般在37攝氏度經1～2h ,產物的生成可達頂峰。為加速反應,可提高反應的溫度,但最高不要超過43攝氏度。保溫的方式采用水浴,將板置于不銹鋼電熱恒溫水浴鍋中,注意可將ELISA 板置于水浴箱中,ELISA 板底應貼著水面,使溫度迅速平衡。為避免蒸發,板一次不宜多于兩塊板同時測定。
2.4 洗滌
洗滌在ELISA 法過程中是很關鍵的一步。ELISA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的,而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。如果洗板被污染或洗滌用水被游離的酶標記物污染、洗滌次數不夠或注水量不足、洗板后間隔時間太久致使板孔干燥等都會直接影響檢測的最終結果,嚴重者實驗不產生顏色致使實驗失敗。
2.5 顯色和比色
顯色是ELISA 中的最后一步溫育反應,此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內,陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中,加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。酸性終止液H2SO4 會使藍色轉變成黃色,此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗,需先將板置于標準96 孔的座架中,才可進行比色。并在加底物液顯色前將軟板邊緣剪凈,以使軟板完全平妥坐入座架中。比色時應以200ng/mL 校零點,且孔在邊緣。然后依次測量不同濃度下的OD 值。
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